无机诱导因子支架材料行颌骨重建的放射学评价

叶茂昌¹，周来生²，康然刚¹，李容新¹，王来平¹，张震东¹

（1.安徽省立医院 口腔医学中心颌面外科研究室，安徽 合肥 230001；

2.美国波士顿大学 分子生物相容学研究室，美国 波士顿）

［摘要］目的：在实验外科的基础上，用预制型无机诱导因子复合性支架材料对颌骨缺损行修复重建，从放射学角度评价组织工程化骨构建的效果。方法：实验组对15只山羊下颌角缺损（30mm×25mm×10mm大小）以预制型支架材料修复，左侧为实验组，右侧为空白对照组，术后分别于4、8、12周处死5只动物行X线检查。临床应用组31例，分别于术后5d、1、2、3、6个月摄取下颌骨全景片和CT，观察骨缺损区的新骨形成情况，并按X线分级评分、6点法和X线阻射密度测量的评分标准测评，对各组的X线评分值及阻射密度值t检验。结果：实验组骨缺损放射影像评分及新生骨情况在4、8、12周显著优于对照组，空白对照组12周时骨缺损区均无明显骨修复现象。临床应用组发现组织工程骨表现出随时间的增长，成骨量逐渐增加的特征，在6个月时，阻射静止期有骨髓重建X线像。结论：预制型无机诱导因子复合性支架材料具有优良的成骨效果，放射学检查对骨缺损的评估有重要意义。

［关键词］无机诱导因子；支架材料；颌骨；缺损；放射学

［中图分类号］ R782.2.3 ［文献标识码］ A

Radiologic evaluation of reconstructing and repairing jaw defect with mineralized induced grafts YE Mao-chang¹,ZHOU Lai-shen², KANG Ran-gang¹,LI Rong-Xin¹, WANG Lai-ping¹,ZHANG Zheng-dong¹(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Oral Medical Center, Anhui Provincial Hospital. Hefei 230001, Anhui Province, China;2.Molecul-Biocompatibility Department, Medical Center, Boston University. Boston,USA)

[Abstract]PURPOSE: The purpose of this study was to evaluate the effect of mineralized induced grafts in reconstruction of jaw defects based on experimental study. METHODS: 15 female goats were operated with 30mm×25mm×10mm defects in bilateral mandible angles. Prefabricated-mineralized induced grafts were put into the left defects and the right without repair as blank controls. After 4,8,12 weeks 5 goats were sacrificed and were taken of X-ray films. In 31 clinical cases. Panoramic X-ray and CT were taken to investigate the new bone growth at 5th day,1st,2nd,3rd and 6th month postoperatively. New bone formation was measured by three different methods and the results were analyzed with Student’s t test. RESULTS: The effect of bone reconstruction of then experimental group was significantly better than that in the control group at 4,8 and 12 weeks. The control group showed no auto-osteogeness and self-repairing at 12th week. In clinical cases. New bone formation increased with time went on; at 6th month, bone marrow recovery was observed by radiographs. CONCLUSIONS: It is concluded that prefabricated-mineralized induced grafts had eligible effect in repairing bone defects. Radiology had significant value in evaluation of new bone growth. Supported by Key Research Project of Anhui Province(Grant No.03021009) and International Scientific and Technical Cooperative Project of Anhui Province(Grant No.04088009)

[Key words] Mineralized induced grafts; Scaffold material; Jaw; Defect; Radiology

China J Oral Maxillofac Surg,2005,3(4):330-334

近年来，口腔颌面外科领域一直在寻找一种理想的组织工程化人工骨材料来重建与修复由创伤、肿瘤和感染等所造成的颌骨缺损。骨组织工程技术的研究正方兴未艾，但是由于现有研究存在支架材料骨诱导性不足、未能兼顾人体骨细胞渗透、新骨形成及新骨内血管再生等不同的特定微环境的综合要求，临床应用尚有很大差距[1]，我们在“分子生物相容学”理论的基础上，应用预制型无机诱导因子复合性工程支架材料，在动物实验研究中证实了其优良的生物相容性和骨诱导性。自2004年1月～9月间，对因肿瘤切除所致的颌骨缺损志愿者31例使用本支架材料进行修复重建，并使用放射学分析来评估其修复骨缺损的能力，并报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验研究

1.1.1 实验材料 成年健康雌性山羊15只，体重35～40kg，由安徽农业大学实验动物中心提供并饲养。

预制型无机诱导因子复合性工程支架材料，由美国波士顿大学生物相容学研究室发明，江苏阳生生物工程公司研制，系国家863项目技术发明产品，主要成分为具有特定化学比例、结晶度的钙、磷无机元素的化合物，直径200～600µm，具有孔隙率>90%的三维立体结构；颗粒中含有大量纳米级微孔，比表面积达到192m²/g，具有可降解性。其毒理试验、致畸和致癌试验、免疫反应试验等均经SFDA药品生物制品鉴定所等相关机构核定，符合SFDA规定的相关产品标准。

1.1.2 实验设计 采用自身配对设计，观察山羊下颌角部制备的缺损模型的内构建情况，将15只山羊按4、8、12周3个时间点分成 3组，每组5只。

1.1.3 缺损模型制备 手术制备山羊双侧下颌解为30mm×25mm×10mm的箱状缺损（图1），左侧置入支架材料，右侧作为空白对照。常规圈养，术后14d拆线。

1.1.4 研究内容 术后4、8、12周，分别随机处死1组5只山羊，行2侧对照的X线摄片。拍摄时取相同照射条件：电压55kV，电流55Ma，曝光时间0.3s，焦距90cm。

图1.山羊下颌角缺损区的制备

Figure 1. Box defect was created in the mandible angle of the goat

1.2 临床研究

1.2.1 一般情况 2004年1～9月间，我院因肿瘤切除所致颌骨缺损志愿者使用本材料的患者31例，其中男23例，女8例；年龄14～74岁。颌骨囊肿26例，囊性成釉细胞瘤5例；上颌骨7例，下颌骨24例；缺损最大12cm×3.5cm×1.5cm，最小4.0cm×3.0cm×1.0cm，均未出现病理性骨折，置入支架材料最多14g，最少3g，平均4.5g。

1.2.2 手术步骤 按常规从口内或口外径路暴露颌骨病变区并开窗，沿囊壁之间剥离囊肿，然后以磨钻从粗齿到细齿麿削骨壁。于创腔内置入支架材料，轻压平齐颌骨表面，以骨腔渗出鲜血浸润，逐层缝合。术后常规抗感染处理，除出现局部消肿均无其他并发症发生，创口均一期愈合。

1.2.3 X线检查 分别于术后5d、1、2、3、6个月拍摄下颌骨全景X线片，观察骨缺损区的新骨形成情况，并按术后X线分级评分、6点法评分和X线阻射密度测量值3项放射线评分标准测评。术后X线分级的评分标准：（1）骨膜反应（最高4分）：无0分；轻微骨膜反应局限于骨创边缘为1分；骨膜反应延伸至骨缺损表面，反应面积<1/4为2分；骨膜反应面积>缺损面积的1/2且<3/4为3分；骨膜反应覆盖整个缺损创面为4分；（2）截骨线（最高为4分）：骨缺损区X线完全透射为0分；骨缺损区X线部分透射为2分；骨缺损区无透射阴影为4分；（3）缺损区骨重建量（最高为4分）：无重建影像为0分；髓腔内示部分重建影像为2分；皮质骨部示骨重建影像为4分；（4）充填材料在骨缺损区的表现（最高4分）：无变化为0分；轻微吸收为1分；由新生骨组织适度替代为2分，大部分由新生骨组织替代为3分；完全由新生骨组织替代为4分；4项得分相加，满分28分。其中前3项，宿主－充填材料接触面情况单独计分。6点评分法评分标准：0分－缺损区无新骨；1分－新骨形成量低于25%；2分－新骨形成量低于50%；3分－新骨形成量低于75%；4分－新骨形成量低于100%；5分－100%完全成骨。取3位影像学专科医生独立读片后评分的均数进行评估。

1.3 统计学分析

实验数据用χ¯±s表示，若两样本方差相等，采用方差相等情形的两样本t检验；若两样本方差不齐，采用近似t检验，P<0.05为差异有显示性。

2 结果

2.1 实验结果

实验组4周时骨缺损区呈模糊状态透射阴影；8周时缺损区有近似骨密度的阻射影，桥接部间隙模糊；12周时桥接部融合完成，表现为规律的纹理，结构清晰，密度较均匀。对照组4、8周时为明显透光阴影，桥接间隙清晰；12周时表现为稍模糊的透光阴影（图2）。

2.2 临床X线检查结果

术后5d，骨缺损区为浅淡点絮状阴影，呈毛玻璃样改变；术后1个月为模糊成片骨阻射阴影，其间有明显的桥接部模糊间隙，部分已与宿主骨融合；术后2个月上述影像进一步致密阻射；术后3个月基本呈骨密度阻射阴影，但骨小梁紊乱，组织材料界面可见极模糊间隙；术后6个月，全部患者的组织工程骨和宿主骨融合，骨小梁已清晰排列，界面间隙已消失，骨松质部位密度下降，明显低于骨皮质，新生骨皮质与正常骨皮质相连，弧度和厚度接近正常骨（图3）。

图2. 山羊下颌骨各时点的X线片：A.术后4周，B.术后8周，C.术后12周（左侧为实验组，右侧为对照组）

Figure 2. X-ray features of the mandible at different times after operation.A.4 weeks postoperatively,B.8 weeks postoperatively,C.12 weeks postoperatively(L: experimental group, R: control group)

图3. 患者下颌骨各时点的全景表现：A.术后5d，B.术后1个月，C.术后2个月，D术后3个月，E.术后6个月

Figure 3. Panoramic features of the mandible at different times after operation. A.5 days postoperatively, B.1 month postoperatively,C.2 months postoperatively, D. 3 months postoperatively, E.6 months postoperatively

2.3 X线评价结果

分别采用X线分级评分、6点法和X线阻射密度测量值分析缺损区的新生骨痂量，结果见表1、表2和图4

表1. 术后X线分级评分(χ¯±s)

Table 1. Scores of X-ray evaluation at different times(χ¯±s)

组别	时间
	5d	4周	8周	12周	6个月
实验组(n=5)		3.9±0.5	5.0±0.9	5.6±0.5
对照组(n=5)		0.6±0.4	0.6±0.5	0.7±0.5
临床应用组(n=31)	0.5±0.3	3.7±0.5	4.9±0.8	5.3±0.5	5.9±0.5

图4. 6点法(骨生成评分)

Figure 4. Scores of bone formation with 6-points methods

表2. X线阻射密度测量值分(χ¯±s)

Table 2. The values of X-ray radiopaque density(χ¯±s)

组别	时间
	5d	4周	8周	12周	6个月
实验组(n=5)		32.363±1.138	53.619±2.017	67.365±2.003
对照组(n=5)		10.113±0.704	12.026±0.603	13.004±0.902
临床应用组(n=31)	10.101±0.715	36.486±1.028	52.920±2.194	70.745±2.101	9.948±3.311

对4、8、12周的实验组和对照组值分别进行t检验，3个时点的P<0.01，差异有显著性，即实验组和对照组的术后X线分级评分、X线阻射密度测量值均有统计学差异，实验组的成骨效果显著优于对照组。

3 讨论

组织工程化骨构建应该是未来解决有成骨活性的骨缺损重建与修复难题的希望和方向。现代组织工程骨的最新概念是以特定的生物材料或其他能降解的材料在骨缺损区占据特定的解剖位置，并在该区域诱导骨的形成；与此同时，材料逐渐降解吸收，当材料完全吸收时，该部位的新骨全部形成，并取代了支架材料原先占据的位置，这些新生成的具有完整功能的骨即为组织工程化骨。其形成目前一般采用3种策略：即目前大部分实验采用的①细胞和生物材料杂化体系；②只有生物降解材料的体系；③移植的细胞由生物过程发展成微结构的细胞体系。我们的研究证实[4]：在组织工程中，细胞的参与是十分重要的因素。在大块组织缺损时，如骨的修复支架材料周围没有足够的成骨细胞参与是不能成骨的。在空腔型骨缺损中，残腔手术创面都衬有大量的血液和组织液，内有大量的未分化间充质细胞，在骨的创面上也有大量的骨祖细胞(osteogenic precursor cell)。这些成骨性细胞均可进入骨修复支架材料间隙，从而充满整个骨缺损修复区域，然后在无机材料的生物诱导下进行增殖分化，最后形成新骨。只有在骨缺损区没有足够的空腔衬以此类细胞时，才需要用体外培养的细胞，植入骨修复材料后再达到形成新骨的目的。

虽然目前存在诸多以现有理论难以解决的问题，但毕竟在实验研究中取得了不少具有积极意义的发现。本研究应用的预制型无机诱导因子复合性支架材料，是遵循1995年在国际上率先提出的“分子生物相容学”理论而人工合成的物质。“预制性”是按患者解剖形态单个定制的相对称呼，即为生产时统一的材料颗粒形态，用于各型留有骨空腔的填充性修复治疗；“诱导因子”是对有诱导作用物质的总称，其可以是生物蛋白制剂，也可以是非生物蛋白类物质，是将生物材料表面化学成分及表面结构定为可以调节细胞功能的诱导物质，所以对特定的生物材料定义为“具有生物活性”的诱导物质。本研究所用的骨修复材料中，钙与磷的特定成分即为能诱导骨细胞增殖分化的生物诱导因子；称之“无机诱导因子”，是因为材料本身是无机材料，是与含有生物蛋白的材料相对而言；“复合性”工程支架材料是指除钙、磷以外，尚有硅等多种元素组成的材料。

本研究应用的预制型无机诱导因子复合性支架材料，根据分子生物相容学的原理，在实验研究的基础上，本着解决在目前组织工程研究中已存在的诸如物理性能差、不易消毒、易传播疾病、易诱导人体自身超敏反应、游离出的酸性降解产物易引起人体组织免疫及异物反应而影响骨组织再生等一系列潜在缺陷[3]，采用新一代的可降解生物材料，利用其表面化学释放的可溶性钙、磷、硅等无机元素，在达到临界尝试能引发材料和周围细胞的特异性相互作用，从而达到组织工程化骨构建的目的。本研究是在实验研究成功的基础上，结合先期动物实验证实本材料的生物相容性和骨诱导性[4]。为了进一步证实本材料在修复有免疫功能的生物体内骨缺损的可能性及效果。对31例颌骨缺损的志愿者进行即时重建，通过观察发现其有良好的骨重建修复作用。

采用X线光密度值的测定进行定量分析，可较好地解决对新生骨总量的测定，而且在比较时非常方便和准确。本组实验研究的X线摄片提示：支架材料置入后的4，8，12周的连续观察显示，骨的构建随时间的延长而进一步出现阻射递增现象，4周时为模糊、浅淡阻射阴影；12周时为结构清晰、密度较均匀的阻射阴影。X线光密度值可作为骨组织工程中检测支架材料的生物活性和成骨性的主要观察指标。这些结果在临床应用中也得到了证实，并且随着观察时间的延长，观察到了更有意义的结果。在早期的X线片上，组织工程骨表现出随着时间的增长而成骨量逐渐增加。术后5d时，由于支架材料具有无机元素性的非骨性阻射特点，所以X线表现为浅淡阻射和无结构状，类似毛玻璃样阴影；在6个月的远期观察中，可见组织工程骨的阻射呈稳定状态；然而此时，组织工程骨髓腔部位的密度有所下降，逐渐形成较明显的皮质骨并与正常皮质骨相连续，弧度和厚度接近正常皮质骨。据此提示，组织工程化骨构建已经表现出了与宿主骨有良好的结合和塑形，已经有了类似髓腔再通的现象。这个重要的现象证明：组织工程化骨构建能够完全修复骨缺损并逐渐接近正常生理骨的形态与结构，符合正位成骨的过程，即周边软骨形成－软骨钙化－新骨形成－造血骨髓形成。其成骨具有偏心性，渐进性的特点。

为了较精确评估组织工程化骨构建对骨缺损修复的效果，我们参考了Yang等[5]对骨缺损的放射学评分标准：即根据骨膜反应、截骨线、骨重建量以及充填材料在骨缺损区的4个项目计分，从而反映重建骨缺损的动态过程，计分较合理，是一个主观但全面的评分标准。同时，还参考Yasko等[6]对骨缺损处新生骨的面积为标准，半定量化表示新生骨量，评分合理、客观、全面。Tiedeman等[7]对骨折愈合光密度量化的评估方法，即采用骨折部位最低密度与骨折远近端平均密度的比值与表示，能测出矿物含量的细微差别，是一个客观而合理的测量方法。

实验研究表明，采用Yang等的评分标准，实验组4个项目计分发起人优于空白对照组，而两者的本质区别在于是否置入了诱导骨重建的无机诱导因子复合性支架材料。Bruder等[8]认为，骨缺损部位的骨祖细胞缺乏主要是因为骨缺损太大造成的骨缺损重建困难，本研究使用的无机诱导因子支架材料具有促进人体骨细胞再生等兼顾不同的特定微环境的优点，具备良好的成骨效果。放射学评分和骨缺损密度测量组织工程化构建骨与对照组相比具有明显差异，结合其他如ECT、组织学观察等检测手段[4]，证明X线用于观察预制型无机诱导因子复合性支架材料行颌骨缺损组织工程化骨构建的评估有一定意义，为临床应用和探讨其修复骨缺损的能力奠定了基础。

［参考文献］

[1] Kim BS, Mooney DJ. Development of biocompatible synthetic extracellular matrices or tissue engineering. [J]. Trends Biotech. 1998,16(5):224-230.

[2] Zhao M, Xiao G, Berry JE, et al. Bone morphologic protein 2 induces dental follicle cells to differentiate toward a cementoblast/osteoblast phenotype[J]. J Bone Miner Res, 2002,17(8):1441-1451.

[3] Lewandrowski KU, Grsser JD, Wise DL, et al. Bioresorbable bone graft substitutes of different osteoconductivites: A histologic evaluation of osteointegration of poly-based cement implants in rags[J] Biomaterials,2002,21(8):757-764.

[4] 叶茂昌，周来生，陈柯，等.无机诱导因子复合性支架材料修复缺损的组织学观察[J].口腔颌面外科杂志,2005,15(3):247-251

[5] Yang GY, Simmons DJ, Lozano R, et al. The healing of grafts combining freeze-dried and demineralized allogenic bone in rabbits[J]. Clin Orthop, 1994,298:289-294

[6] Yasko AW, Lane JM, Fellinger EJ, et al. The Healing of segmental bone defects, induced by recombinant human bone morphogenetic protein(rhBMP-2). A radiographic, histological, and biomechanical study in rats[J]. J Bone Joint Surg Am, 1992,74(5):659-670.

[7] Tiedeman JJ, Lippieello L, Connolly JF, et al. Quantitative rentgenographic densitometry for assessing fracture healing [J]. Clin Orthop, 1990,253:279-286.

[8] Bruder SP, Jaiswal N, Haynesworth SE. Growth kinetics, self-renewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation [J]. J Cell Biochem, 1997,64(2):278-294.